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原核蛋白表達常見問題分析

更新時間 : 2021-03-04

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原核蛋白表達常見問題分析

原核表達是指通過基因克隆技術構建表達載體並將外源靶基因引入表達菌株,使其可以在特定原核生物或細胞中表達的方法。原核蛋白表達系統是目前最常用和最經濟的蛋白表達方法。大腸桿菌表達系統是最廣泛使用的原核蛋白表達系統之一。

Escherichia coli expression system Features

完整的表達系統通常包括支持表達載體和表達菌株。如果它是特殊的誘導表達,則它還包括誘導劑,融合表達還包括純化系統或Tag檢測。選擇表達系統通常取決於實驗目的,例如表達水平,靶蛋白的活性,表達產物的純化方法等。下面介紹原核表達過程中的常見問題。

 

問:為什麼靶蛋白總是以包涵體的形式出現?

答:在原核表達和純化中,靶蛋白經常會錯誤折疊並聚集成包涵體。誘導後,靶蛋白的表達通常可以達到總細胞蛋白的50%以上。

儘管一定比例的蛋白質以可溶形式存在,但高達95%的蛋白質存在於包涵體中。為了獲得更多的可溶性蛋白,在實驗過程中,可以將誘導溫度降低,例如降低16-30°C,或者可以降低IPTG濃度(0.01-0.1mM),並可以延長誘導時間。也可以使用特殊的培養基來培養細菌。



問:為什麼很難表達跨膜蛋白?

答:跨膜蛋白表達成功率較低是一個普遍的問題。可能有兩個主要原因:

 

1.跨膜蛋白通常由強疏水性氨基酸分子和親水性分子組成,它們以跳躍的方式連接在一起,形成最簡單的親水性和疏水性跨膜化學結構,類似於信號肽的結構。

對於原核細胞,簡單的細胞器很難完成信號肽識別和切除的複雜過程,從而引導內質網和高爾基體像真核細胞一樣重新包裝和分泌。一些蛋白質跨膜多次。對於原核細胞,細胞幾乎不可能完成任務。


2.對於疏水性片段,在原核細胞表達中容易形成包涵體。疏水肽可以抑制翻譯過程,甚至與原核膜結構融合形成毒性。從生物自我保護的本能出發,所有細胞器都會停止蛋白質的合成過程。

 

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